Órfão desde criança, Peter Parker (Tobey Maguire) vive em Nova York com sua querida tia May (Rosemary Harris) e seu estimado Tio Ben (Cliff Roberson). Peter leva a vida normal de qualquer jovem estudante, trabalhando como fotógrafo no jornal Daily Buble, sob a tutela do editor J. Jonah (J. K. Simmons), correndo atrás da atraente Mary Jane (Kirsten Dunst) e divertindo-se com seu amigo Harry Osborn (James Franco). Durante uma excursão da escola, onde Peter e seus colegas assistem a demonstrações científicas com aranhas, Peter é mordido por uma aranha geneticamente modificada. Pouco depois, ele descobre que adquiriu poderes incríveis: ele vê-se dotado com força e agilidade de aranhas. Após descobrir seus poderes incomuns, Peter participa de uma luta televisada, que é vencida por ele em tempo recorde, graças á sua recém-adquirida força de aranha. 

Dois anos se passaram desde que o tranqüilo Peter Parker (Tobey Maguire)separou-se do grande amor de sua vida, Mary Jane Watson (Kirsten Dunst), e decidiu assumir o compromisso e a responsabilidade de seguir sendo o Homem-Aranha. Peter enfrenta novos desafios enquanto aprende a lidar com "seu dom e sua maldição", tentando desesperadamente harmonizar suas duas identidades: a do super-herói aracnídeo, o Homem-Aranha, e a do estudante universitário. Todas as pessoas que Peter mais ama passam a correr perigo quando ele enfrenta o poderoso vilão cheio de tentáculos, o Doutor Octopus,também conhecido como "Doc Ock" (Alfred Molina). O eterno amor que Peter sente por M.J. se torna ainda mais forte à medida que ele luta contra o impulso de abandonar sua vida secreta e declarar seu amor. Enquanto isso, M.J. seguiu com sua vida. Ela se dedica à sua carreira artística e tem um novo par romântico. A grande amizade de Peter e Harry Osborn (James Franco) se complica diante da amargura do jovem Osborn com a morte de seu pai e seu desejo cada vez mais forte de se vingar do Aranha, a quem ele responsabiliza. A vida de Peter se torna ainda mais complicada quando ele precisa enfrentar um novo e poderoso adversário, o dr. Otto Octavius (Molina) - "Doc Ock". Peter deve agora aprender a aceitar seu destino e empregar todos os seus poderes de super-herói para conseguir deter esse louco diabólico. 

Em Homem-Aranha 3, Peter Parker (Tobey Maguire) finalmente conseguiu encontrar o equilíbrio entre sua devoção a M. J. (Kirsten Dunst) e suas obrigações de super-herói. Mas quando sua roupa de Homem-Aranha repentinamente se transforma, tornando-se negra e aumanteando seus podera, ela também transforma Peter. Sob a influência dessa nova roupa, Peter se torna convencido e arrogante, passando ainda a negligenciar as pessoas que mais ama. Enquanto dois dos mais temidos vilões já vistos, Homem-Areia (Thomas Harden Church) e Venon (Topher Grace) se unem pra arquitetar uma incrível vingança contra o Homem-Aranha, a maior batalha de Peter é consigo mesmo. O Homem-Aranha vai ter que redescobrir a compaixão que faz ele ser quem realmente é: um herói.